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細(xì)胞滾動粘附實驗--間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原蛋白I表面的血栓沉積研究
2016-06-13 14:45:53 來源：細(xì)胞滾動粘附實驗--間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原蛋白I表面的血栓沉積研究
間充質(zhì)干細(xì)胞在急性或慢性心肌缺血的研究中展示出其是一個非常理想的細(xì)胞治療候選。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞在作為冠狀動脈注射細(xì)胞治療時的安全性還有待評估。一個理想的方法是使用病人自身的干細(xì)胞進行增殖后用于治療。愛爾蘭的科研人員針對間充質(zhì)干細(xì)胞對于細(xì)胞治療的安全性進行了研究。其主要針對于間充質(zhì)干細(xì)胞天生的血栓前特性和在心肌梗塞后向冠狀動脈遷徙治療的安全性進行了研究。 其中，研究人員進行了了流動狀態(tài)下血栓集結(jié)在膠原蛋白上的實驗。同時，研究人員還用熒光底物測定的實驗來研究間充質(zhì)干細(xì)胞在無血小板血漿中的凝血酶的產(chǎn)生情況。
研究人員在做血栓沉積實驗時使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)，將膠原蛋白I鋪在道載玻片上觀測間充質(zhì)干細(xì)胞在10dyn/cm2的情況下的粘附情況。
Stem Cells. 2015 Sep;33(9):2726-37. doi: 10.1002/stem.2050. Epub 2015 Jun 4.
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Have Innate Procoagulant Activity and Cause Microvascular Obstruction Following Intracoronary Delivery: Amelioration by Antithrombin Therapy.
Gleeson BM1, Martin K1, Ali MT1, Kumar AH1, Pillai MG1, Kumar SP1, O'Sullivan JF1, Whelan D1, Stocca A1, Khider W1, Barry FP2, O'Brien T2, Caplice NM1.
一、實驗準(zhǔn)備實驗材料及設(shè)備
1）細(xì)胞： 豬分離MSC細(xì)胞（mesenchymal stem cell）
豬源FB細(xì)胞（fibroblast）
豬源EC細(xì)胞（endothelial cell）
2）培養(yǎng)基：Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification（α-MEM）
3）試劑： mouse anti-human TF （clone：HTF-1）
IgG
Collagen I
Heparin
4）培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.4 Luer （ibidi，Germany，80176）
灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
96孔黑色免疫熒光板 （ ibidi， Germany，89626）
5）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）
Wallac Victor fluorimeter
multicolour fluorescent microscopy （Nikon）
二、實驗方法
在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
一）細(xì)胞滾動粘附實驗：
1）載玻片包被：
① 將100μl 的 250μg/ml的膠原蛋白I型溶液，注入通道中。
② 室溫孵育60分鐘
③ 吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用
2）準(zhǔn)備滾動粘附實驗
① 搭建流體系統(tǒng)，灌流管按照說明放在置在流體單元上，加入少量無細(xì)胞培養(yǎng)基，運行去氣泡程序。
② 連接通道載玻片，將上述通道載玻片中加滿無細(xì)胞培養(yǎng)基，兩側(cè)注液孔中液體要是過滿狀態(tài)，之后再將灌流管和載玻片相連。
圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好。
③ 檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲液管液面不會下降或者上升，那么，整個系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的。
3）開始滾動粘附實驗（單向?qū)恿鳎＿B接好載玻片的灌流管中加入用全血血漿重懸的間充質(zhì)干細(xì)胞。 再將流體單元與ibidi泵相連，以 10dyn/cm2的剪切力開始流體實驗。用nikon顯微鏡采集圖像，每5分鐘拍攝一張照片。
三）凝血酶的測定--熒光底物測定實驗
1）去血小板血漿可以通過2500g離心15分鐘全血得到。
2）間充質(zhì)干細(xì)胞重懸在去血小板血漿中，以加入HTF-1和IgG為對比，用FB和EC作為對照。
3）加入thrombin generation assay（TGA）試劑，并且用ibidi 96孔板檢測凝血酶的濃度。
三 實驗結(jié)果
一）滾動粘附實驗
如圖所示，使用全血作為對照（WB），可以看到間充質(zhì)細(xì)胞有非常顯著的粘附行為，而加入肝素的間充質(zhì)細(xì)胞，粘附行為又有非常顯著的下降。
二）凝血酶的測定
如圖所示，以MSC溶血酶濃度加入α-TF比IgG要多得多。而MSC比FB也有非常顯著的差異。
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